贞观二十三年（649年），李世民驾崩，武则天依例与部分没有子女的嫔妃们一起入长安感业寺为尼，但她与新即位的唐高宗李治一直藕断丝连。
再次入宫
永徽元年（650年）五月，李治在为祭奠李世民周年忌日而入感业寺进香时，又与武则天相遇。两人相认，并互诉离别后的思念之情。因无子而失宠的王皇后看在眼里，便主动向李治请求将武则天纳入宫中，企图以此打击她的情敌萧淑妃。李治早有此意，当即应允。
永徽二年（651年）五月，李治的孝服期已满，武则天便再度入宫。入宫前，武则天已怀孕，入宫后便生下儿子李弘。武则天回宫后，迅速打败萧淑妃，获得李治的宠爱。至次年（652年）五月，武则天便被拜为二品昭仪。当时王皇后、萧淑妃经常与其争宠，互相诋毁，但李治都不听。
武则天题跋像
武则天工于心计，心狠手辣，兼涉文史。永徽五年（654年），武则天产下长女安定思公主，据《新唐书》和《资治通鉴》记载，在安定思公主出生后一月之际，王皇后来看望，怜爱并逗弄公主玩，王皇后走出去后，武则天趁没人将女孩掐死，又盖上被子掩饰。
正好李治来到，武则天假装欢笑，打开被子一同看孩子，发现女儿已经死了，武则天啼哭。问身边的人是怎么回事，身边的人都说：“皇后刚刚来过这里。”李治勃然大怒，说道：“皇后杀了我的女儿！”武则天于是哭泣着数落王皇后的罪过。王皇后无法解释清楚，李治从此有了”废王立武“的打算（但此事有争议，成书于五代的《旧唐书》和《唐会要》只记载了公主的暴卒，并未言明其死因）。
永徽六年（655年）六月，在后宫有谣言说王皇后与其母柳氏行厌胜之术，李治得知后大怒，将柳氏赶出皇宫，而且还想把武则天由昭仪晋封为一品宸妃，由于受到宰相韩瑗和来济的反对，最后才不能成事。当时朝廷以长孙无忌、褚遂良为首的元老大臣势力强大，李治的权力受到很大限制。以长孙无忌为首的很多大臣反对唐高宗废王立武，武则天前进的道路也因此充满艰辛。李治企图借“废王立武”重振皇权，打击元老大臣势力。于是，武则天开始成为李治政治上的“战友”。
不久，中书舍人李义府首个支持”废王立武“，得到李治和武则天的重赏，很多中层官员看到支持“废王立武”有利可图，便转而支持立武则天为后。许敬宗、崔义玄、袁公瑜等大臣纷纷请求李治立武则天为后，李治看到有不少人支持，废立之意再次萌生。
功臣元老中的李说了一句“此陛下家事，何必问外人”，彻底打动了李治的心，使李治和武则天在废立皇后的问题上的不利局面一下扭转过来了。同年十月十三日，李治终于颁下诏书：以“阴谋下毒”的罪名，将王皇后和萧淑妃废为庶人，并加囚禁；她们的父母、兄弟等也被削爵免官，流放岭南。